下面是將乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌生產(chǎn)乙肝疫苗的過程及有關(guān)資料，請分析回答下列問題。
【資料1】巴斯德畢赤酵母菌是一種甲基營養(yǎng)型酵母菌，能將甲醇作為其唯一碳源，此時AOX1基因受到誘導(dǎo)而表達(dá)【5’AOX1和3’AOX1（TT）分別是基因AOX1的啟動子和終止子】。
【資料2】巴斯德畢赤酵母菌體內(nèi)無天然質(zhì)粒，所以科學(xué)家改造出了圖1所示的pPIC9K質(zhì)粒用作載體，其與目的基因形成的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后可以與酵母菌染色體發(fā)生同源重組，將目的基因整合于染色體中以實現(xiàn)表達(dá)。
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若要獲得抗病基因，能否用限制酶SmaⅠ對圖中對應(yīng)的位點進(jìn)行切割？說明理由。要獲得含抗病基因的重組質(zhì)粒能否用PstⅠ、ApaⅠ限制酶切割質(zhì)粒？
此基因與細(xì)菌的質(zhì)粒相結(jié)合要依靠（）酶和（）酶，其作用部位是磷酸二酯鍵，然后將目的基因移植到酵母菌體內(nèi)，酵母菌在基因工程中叫（）。
獲取目的基因途徑有（）、（）。
仔鼠出生后可用其尾巴進(jìn)行DNA檢測，通過（）方法，檢測出攜帶外源基因的小鼠。至于外源基因是否合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，可從轉(zhuǎn)基因小鼠中提取蛋白質(zhì)，并用相應(yīng)的抗體進(jìn)行（）雜交，若有雜交帶出現(xiàn)，則表明小鼠體內(nèi)的外源基因（）。
圖中科學(xué)家在進(jìn)行①操作時，要用同一種（）分別切割目的基因和運載體，運載體的黏性末端與目的基因DNA片段的黏性末端就可通過（）（鍵名）而結(jié)合，遵循（）原則。
科學(xué)家在培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物時，常用（）中的質(zhì)粒做運載體。
②、③階段是否可使用同種培養(yǎng)基？理由是什么？
圖中的III是導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、篩選最終獲得一株有抗蟲特性的轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)分析，該植株含有一個攜帶目的基因的DNA片段，因此可以把它看作是雜合子。理論上，在該轉(zhuǎn)基因植株自交產(chǎn)生的F1中，仍具有抗蟲特性的植株占總數(shù)的（），原因是（）。
基因工程操作的基本步驟是：①（）；②（）；③（）；④（）。
述抗蟲棉植株的后代種子種植下去后，往往有很多植株不再具有抗蟲性，原因是（），要想獲得純合體，常采用的方法是（）。